Non-Coding RNA bei Krebserkrankungen

Non-Coding RNAs (ncRNAs) haben in den letzten Jahren in der Krebsforschung zunehmend Bedeutung erlangt, und darüber hinaus im Bereich translationaler Forschung sowohl als Biomarker als auch als therapeutische Ziele. Das komplexe Zusammenspiel verschiedenster ncRNAs in Bezug auf die Krebsentstehung macht die Interpretation von Forschungsergebnissen und deren Implementierung in der klinischen Praxis äußerst anspruchsvoll. Einige klinische Studien werden/wurden bereits durchgeführt, um die diagnostische, prognostische oder prädiktive Rolle von ncRNAs im klinischen Alltag zu testen und womöglich neue Biomarker zu entdecken.

Grundlagen

Non-Coding RNAs (ncRNAs) werden nach einer willkürlichen Definition nach deren Länge – unter und über 200 Nukleotiden – in zwei Gruppen eingeteilt: lange (long) (lncRNAs; u. a. long intergenic ncRNA [lincRNA], circularRNA [circRNA], natural antisense transcript [NAT]) und kurze (small) non-coding RNAs (u.a. mikroRNA [miRNA], P-element-induced-wimpy testis [piwi]-interacting RNA [piwiRNA]).1 Allen ncRNAs, von denen bis heute mehrere Tausend beschrieben wurden, ist gemeinsam, dass sie (üblicherweise) keine Proteine codieren, wobei auch hier Erkenntnisse der letzten Jahre Ausnahmen gezeigt haben und im Speziellen die Kodierung von Mikro-Peptiden entdeckt werden konnte. Zieht man in Betracht, dass nur 3 % des menschlichen Genoms in Protein-codierende messengerRNA (mRNA) transkribiert wird, dürfte die Menge unerforschter ncRNA wesentlich höher liegen als bisher angenommen. Jede Subgruppe von ncRNAs zeichnet sich durch spezifische Funktionen im Genom aus. So blockieren miRNAs die Translation von mRNAs, indem sie an deren 3’ untranslated region (3’UTR) binden.2 LncRNAs wiederum regulieren die Genexpression, fungieren als Scaffolds oder Decoys für verschiedenste RNA-Moleküle. Da ncRNAs wichtige Funktionen in der Regulation der Genexpression innehaben und somit wesentliche zelluläre Prozesse steuern, ist ihre Dysregulation mit vielen Krebserkrankungen assoziiert.3

Potenzial

Aufgrund ihres ubiquitären Vorkommens und vielseitigen Funktion können ncRNAs als präventive, diagnostische, prognostische und prädiktive Marker sowie als therapeutisches Target dienen.

Während in der Vergangenheit gewebsbasierte Biomarker zur Anwendung gekommen sind, hat die Bedeutung minimalinvasiver Methoden – d. h. Liquid Biopsy – in den letzten Jahren an Aufmerksamkeit gewonnen. Auch einige ncRNAs eigenen sich als derartige Biomarker, da sie in Exosomen eingeschossen in Köperflüssigkeiten zu finden sind.1 Insbesondere piwiRNAs, welche die Chromatinveränderung und Transposon-Expression regulieren, sind in solchen Exosomen zu detektieren. So konnte etwa mithilfe eines miRNA- und piwiRNA-basierenden molekulargenetischen Profils zwischen Plasma von Patienten mit einem Malignom (d. h. Prostata-, Kolorektal-, Pankreaskarzinom) und gesunden Probanden unterschieden werden.4 Interessanterweise finden sich bis zu 6-fach erhöhte ncRNA-Konzentrationen in Exosomen verglichen mit dem Inhalt der sie produzierenden Zellen, ein weiterer Vorteil der blut- bzw. plasmabasierenden Methode.5

Prostatakarzinom: So ist etwa Prostate Cancer Associated 3 (PCA3) in über 95 % im Urin von Patienten mit primärem und metastasiertem Prostatakarzinom überexprimiert und weist als diagnostischer Biomarker sogar eine höhere Spezifität – wenn auch niedrigere Sensitivität – als der PSA-Wert auf.6, 7 Als Beispiel für einen prädiktiven minimalinvasiven Biomarker kann miR-21 dienen, deren ­Levels im Plasma signifikant höher bei Patienten mit Docetaxel-resistentem Prostatakarzinom im Vergleich zu Patienten mit Docetaxel-sensitivem Prostatakarzinom sind.8

Mammakarzinom: Für das Mammakarzinom wiederum ist miR-21 ein sensitiver und spezifischer diagnostischer Biomarker.9 Ein weiterer dearartiger Biomarker für das Mammakarzinom stellt die lncRNA HOX Transcript Antisense RNA (HOTAIR) dar, welche die Rekrutierung des Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) an diverse Orte des Genoms reguliert und somit eine epigenetische Gen-Stilllegung verursacht. Unabhängig vom Hormonrezeptorstatus ist HOTAIR im Plasma von Mammakarzinom-Patienten im Vergleich zu gesunden Probanden erhöht und hat eine bessere diagnostische Aussagekraft als Carcinoembryonic Antigen (CEA) und Cancer Antigen 153 (CA153).10

Bronchialkarzinom: Ähnliche Resultate konnten für HOTAIR und das Auftreten eines nichtkleinzelligen Bronchialkarzinoms gezeigt werden.11 Bei Erkrankten sind die HOTAIR-Werte im Plasma deutlich höher als bei gesunden Individuen, wobei die Kombination aus HOTAIR und CEA das Diskriminationspotenzial zwischen Bronchialkarzinom-Patienten und gesunden Probanden deutlich erhöht.11 Auch miR-21 spielt beim nichtkleinzelligen Bronchialkarzinom eine diagnostische und möglicherweise sogar prädiktive Rolle; miR-21-Plasma-Werte verringern sich bei Patienten unter platinumbasierender Chemotherapie deutlich, sofern ein Therapieansprechen zu erkennen ist.12
Nicht nur einzelne, sondern auch Kombinationen aus mehreren ncRNAs können eine Aussagekraft über das Bestehen, Voranschreiten oder Ansprechen von Krebsarten ermöglichen. Für das nichtkleinzellige Bronchialkarzinom konnte etwa gezeigt werden, dass die Kombination aus einem 24-miRNA Signature Classifier mit einem Low-Dose CT die Sensitivität für das Vorhandensein eines Tumors auf 98 % bei Hochrisikopatienten erhöht (Spezifität: 65 %).13 Des Weiteren erlaubt die Kombination aus miR-21 und miR-375 eine Unterscheidung zwischen Prostatakarzinom-Patienten und gesunden Probanden, wobei hohe Serum-Werte zusätzlich mit einem kastrationsresistenten Zustand assoziiert sind.14, 15

Praxis

Wichtig ist, zu beachten, dass ein und dieselbe ncRNA vielseitige Wirkungen haben und ganze Funktionsnetzwerke bilden kann, was wiederum die Interpretation und Anwendung von Forschungsergebnissen äußerst komplex gestaltet. Außerdem kann eine bestimmte ncRNA für mehrere Tumorentitäten denselben Biomarker darstellen, wie oben am Beispiel von miR-21 und HOTAIR beschrieben. Des Weiteren müssen Blut-, Plasma- und Urinproben speziell gelagert und aufbereitet werden, um dem natürlichen Abbau der ncRNAs entgegenzusteuern. Während miRNAs im Vollblut etwa 24 Stunden stabil sind, verringert sich diese Zeit nach Aufteilung in die Blutkomponenten deutlich.16 Für die Isolation von ncRNAs gibt es heute mehrere Kits (z. B. miRCURY, miRNeasy), wobei diese jeweils spezifisch bestimmte miRNAs favorisiert isolieren.17 Darüber hinaus können miRNA-Signaturen sowohl auf Basis totaler RNA als auch short ncRNA-angereicherter Fraktionen erstellt werden.18
Auch hierdurch ist die Datenreproduzierbarkeit weiterhin erschwert. Der wichtigste analytische Schritt ist die Quantifizierung der ncRNA, wobei am häufigsten qRT-PCR und NGS-basierende Methoden zur Anwendung kommen.1 Darüber hinaus wird in den meisten Studien das Blut-/Plasma-/Harnvolumen festgelegt, während die darin befindliche Menge an ncRNAs von Probe zu Probe variiert.19 Um eine Reproduzierbarkeit der Daten zu erlauben, gibt es daher die Möglichkeit, eine (absolute oder relative) Datennormalisierung durchzuführen. In einem letzten Schritt werden die Exosomen mittels Ultrazentrifugation gewonnen, wobei das endgültige Ergebnis wesentlich von den vorhergegangenen Schritten abhängt, was eine Standardisierung und Reproduzierbarkeit derzeit schwierig macht.20

Diagnose-Assay und Therapieansatz

PCA3 ist die einzige zirkulierende ncRNA, die als ein diagnostischer Biomarker für das Bestehen eines Prostatakarzinoms von der FDA bisher zugelassen wurde.1 Viele weitere Studien sind derzeit im Gange, um einen Zusammenhang zwischen ncRNAs und Auftreten, Progress und Therapieansprechen diverser Tumorentitäten zu klären.
Die erste therapeutisch getestete ncRNA ist MRX-34, eine miR-34 Mimic, welche in Liposomen über die Vene in den Blutkreislauf von Patienten mit fortgeschrittenem oder metastasiertem hepatozellulärem Karzinom infundiert wird (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01829971). In präklinischen Studien konnte gezeigt werden, dass die Injektion von mRX34 das Tumorwachstum bei Leberkrebserkrankungen reduziert.21 Allerdings musste die klinische Studie aufgrund von schweren immunassoziierten Ereignissen vorzeitig beendet werden, was die Komplexität der Anwendung ncRNA-basierender Therapeutika aufzeigt. Mutmaßlich spielt die Interaktion mit Toll-like-Rezeptoren beim Overloading des Organismus mit Fremd-RNA bei dieser Nebenwirkung eine Rolle. Diese Studie kann als Beispiel für die Grenzen der ncRNA-basierenden Therapie dienen, da die mannigfaltigen Wirkungen einer singulären ncRNA auch nach intensivierter Forschung nur schwer greifbar werden.

Zusammenfassend stellen nichtkodierende RNA-Moleküle einen immer noch interessanten Bereich der Krebsforschung dar, weitere Anwendungen mit klinischer Relevanz würden diese spezielle Forschungsrichtung auf eine neue Ebene stellen.

 

 

 

1 Anfossi S et al., Clinical utility of circulating non-coding RNAs – an update. Nat Rev Clin Oncol 2018; 15:541–63
2 Berindan-Neagoe I et al., MicroRNAome genome: a treasure for cancer diagnosis and therapy. CA Cancer J Clin 2014; 64:311–36
3 Bartonicek N et al., Long noncoding RNAs in cancer: mechanisms of action and technological advancements. Mol Cancer 2016; 15:43
4 Yuan T et al., Plasma extracellular RNA profiles in healthy and cancer patients. Sci Rep 2016; 6:19413
5 Li Y et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis. Cell Res 2015; 25:981–4
6 Hessels D et al., DD3(PCA3)-based molecular urine analysis for the diagnosis of prostate cancer. Eur Urol 2003; 44:8–15; discussion -6
7 Lee GL et al. Prostate cancer: diagnostic performance of the PCA3 urine test. Nat Rev Urol 2011; 8:123–4
8 Zhang HL et al., Serum miRNA-21: elevated levels in patients with metastatic hormone-refractory prostate cancer and potential predictive factor for the efficacy of docetaxel-based chemotherapy. Prostate 2011; 71:326–31
9 Han JG et al., A novel panel of serum miR-21/miR-155/miR-365 as a potential diagnostic biomarker for breast cancer. Ann Surg Treat Res 2017; 92:55–66
10 Zhang Y, et al., Circulating long non-coding HOX transcript antisense intergenic ribonucleic acid in plasma as a potential biomarker for diagnosis of breast cancer. Thorac Cancer 2016; 7:627–32
11 Li N et al., Identification of Circulating Long Noncoding RNA HOTAIR as a Novel Biomarker for Diagnosis and Monitoring of Non-Small Cell Lung Cancer. Technol Cancer Res Treat 2017:1533034617723754
12 Wei J et al., Identification of plasma microRNA-21 as a biomarker for early detection and chemosensitivity of non-small cell lung cancer. Chin J Cancer 2011; 30:407–14
13 Sozzi G et al., Clinical utility of a plasma-based miRNA signature classifier within computed tomography lung cancer screening: a correlative MILD trial study. J Clin Oncol 2014; 32:768–73
14 Bryant RJ et al., Changes in circulating microRNA levels associated with prostate cancer. Br J Cancer 2012; 106:768–74
15 Nguyen HC et al., Expression differences of circulating microRNAs in metastatic castration resistant prostate cancer and low-risk, localized prostate cancer. Prostate 2013; 73:346–54
16 Glinge C et al., Stability of Circulating Blood-Based MicroRNAs – Pre-Analytic Methodological Considerations. PLoS One 2017; 12:e0167969
17 El-Khoury V et al., Assessing cellular and circulating miRNA recovery: the impact of the RNA isolation method and the quantity of input material. Sci Rep 2016; 6:19529
18 Jarry J et al., The validity of circulating microRNAs in oncology: five years of challenges and contradictions. Mol Oncol 2014; 8:819–29
19 Fernandez-Mercado M et al. The circulating transcriptome as a source of non-invasive cancer biomarkers: concepts and controversies of non-coding and coding RNA in body fluids. J Cell Mol Med 2015; 19:2307–23
20 Baek R et al., The impact of various preanalytical treatments on the phenotype of small extracellular vesicles in blood analyzed by protein microarray. J Immunol Methods 2016; 438:11–20
21 Bader AG. miR-34 – a microRNA replacement therapy is headed to the clinic. Front Genet 2012; 3:120